来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/294671458）
病毒样颗粒(Virus like particle, VLP)是由一个或多个具有自组装能力的不同分子组成的病毒衍生结构。它在结构上模仿病毒颗粒的形状和大小，但缺乏遗传物质，因此无法感染宿主细胞。病毒结构蛋白的表达和自组装可以在各种活的或无细胞的表达系统中发生，之后病毒结构可以被组装和重建。
VLP凭借其卓越的免疫原性，在预防医学领域内迅速崛起，成为疫苗开发的前沿技术。与传统的灭活病毒疫苗相比，VLP疫苗通过模拟自然感染过程中病毒的外部结构，诱导机体产生强烈的免疫反应，而无需引入具有潜在致病性的完整病毒或其遗传物质，这一特性显著增强了疫苗的安全边际。至今，科研人员已经利用VLP技术，成功研发出多种对抗重大传染病的候选疫苗，涵盖了从人乳头瘤病毒（HPV）导致的宫颈癌预防，到乙型肝炎、戊型肝炎等病毒性肝炎的防护，乃至季节性流感和禽流感等呼吸道疾病的防控。
为了确保最终产品的质量，以及为开发过程中提供坚实的数据支持，我们需要切实可靠的质控及分析技术[1-2]。
图1 VLP 疫苗的制备工艺和应用
用于VLP疫苗质量研究的指标包含有：抗原结构确证、抗原均一性、杂质控制、免疫学活性评估以及安全性等。其中涵盖了多种的生物化学、免疫活性、生物表征的手段，具体如表1所示[3-4]。
表1 VLP疫苗的质控与表征
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理化表征
VLP 的生化表征涉及包括氨基酸序列、分子量、等电点和纯度等（图2）。VLP的分子量可以使用基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱法（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）测量。质谱除了可用于分析组装蛋白质的分子量、蛋白质序列和氨基酸组成，与液相色谱的连用还可以提供分子量、二硫键键、化学修饰的详细结构信息。因此，液相色谱-质谱（Liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS）技术是生产基于VLP的疫苗的强大表征工具。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）和反相高效液相色谱（Reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC）是用于测定VLP纯度、完整性和分子量的最常用方法。蛋白质经SDS-PAGE电泳后按分子量大小分离开来，如果蛋白样品只含有一种蛋白质，那么其电泳后只会显现一个唯一的蛋白条带。但如果一个蛋白样品中含有多种大小不同的蛋白，那么电泳后不同的蛋白质会被分离成大小不同的蛋白条带。因此，可以利用SDS-PAGE的分离作用进行蛋白纯度鉴定，也可用于验证蛋白样品的纯化效果。SDS-PAGE的优点是不需要特殊设备，但主要缺点是费力且耗时。而RP-HPLC则由于其高灵敏度和可重复性，在测量基于VLP疫苗的纯度和质量方面更具有吸引力。此外，RP-HPLC方法还可用于表征病毒糖蛋白的翻译后修饰，以及产品配方与稳定性开发[5]。
图2 用于VLP的理化表征
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生物物理表征
VLP的生物物理参数，如形态、大小和多分散性，有助于VLP疫苗的效力和安全性的评估（图3）。VLP的完整性和形态可以通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM）、冷冻电子显微镜（Cryogenic electron microscopy, Cryo-EM）和原子力显微镜（Atomic force microscope ,AFM）等可视化技术来检测。透射电镜是VLP可视化和测量粒度最常用的技术，但由于样品制备过程中的颗粒变形，这可能会造成对颗粒浓度和对粒度的误判。而Cryo-EM和AFM则可以极大程度避免颗粒的变形。此外，AFM即使在环境条件下也能测量粒度和粒度分布，可以对单个颗粒进行成像，而无需高昂的样品制备成本[6-7]。
VLP粒径的测量是通过非对称流场-流动分馏结合多角光散射（AF4 Multi-angle light scattering, AF4-MALS）、动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）、电喷雾差迁移率分析（Electrospray-differential mobility analysis, ES-DMA）和高性能尺寸排阻色谱（High Pressure Size Exclusion Chromatography, HPSEC）完成的。DLS和MALS是非侵入性技术，都是通过光的散射技术来获得溶液中粒子大小和浓度。但是，这两种技术对大颗粒的浓度测量可能并不准确。另外，ES-DMA 和 AF4-MALS 也是表征多模态 VLP 分布的快速定量方法。
圆二色性（Circular dichroism, CD）、紫外（Ultraviolet, UV）光谱、差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry, DSC）和分析超速离心已被用于粗略表征VLP的生物物理特性。其中，VLP的二级和三级结构可以通过CD和UV光谱法测量。用于快速、稳健定量 VLP 的其他分析技术还包括有 HPSEC-MALS、AF4-MALS 和纳米颗粒跟踪分析 (Nanoparticle tracking analysis，NTA)等方法。与 HPSEC-MALS 相比，NTA 方法已被证明能够以更高的灵敏度直接定量颗粒浓度非常低的样品。但正是由于它的高灵敏性，NTA分析技术通常需要繁琐的样品稀释步骤，且NTA测量的浓度结果一般会比实际值稍高[8]。此外，分析型超速离心(Analytical ultracentrifugation, AUC)技术也是确定VLP大小、构象和分子量的准确方法之一。
图3 用于VLP的生物物理表征
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生物学表征
VLP 的生物学表征一般通过分析 VLP 的功能表位与特异性单克隆抗体的结合来进行。这种结合活性是疫苗体内安全性和有效性的首选指标。如图4所示，表面等离子体共振（Surface plasmon resonance, SRP）和酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）等多种免疫测定方法已被用于分析抗体与VLP的结合亲和力。
SPR是常规的亲和力检测技术，作为制药行业的“金标准”已被收录进《2020版中国药典》，它可以提供实时的分子相互作用信息，以监测分子的整个结合过程。但此方法需要确保样品充分水溶，且不能含有蔗糖、甘油、咪唑等高折光成分，此外其对蛋白纯度和浓度也有要求（纯度＞90%、浓度＞1mg/mL）[9]。与之相反的是，ELISA包被的抗原浓度则要尽量的小，以得到合适的信号值。
图4 用于VLP的生物学表征
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其他质控指标
此外，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）为确保VLP 疫苗的质量可靠、有效，自2006年生物标准化专家委员会成立以来，一直持续关注于该领域的相关质控，并发布系列指南。如表2所示WHO就人乳头瘤病毒(Human papilloma virus, HPV) VLP疫苗的指南做了更新，并对常规检查项做出了要求，具体包含有外观、pH等[10]。
表2 VLP HPV疫苗的WHO标准
结语
VLP是开发候选疫苗的重要平台，已成功应用于多种癌症的预防。尽管如此，由于VLP分子量大、结构复杂，它们的表征也具有较大的挑战性。同时，在工艺开发和产品检测过程中，还需要额外关注疫苗颗粒的结构完整性和结构变化情况。因此，除常规蛋白质的检测技术外，一些新型的分析检测技术已经在VLP疫苗产品开发中，发挥了越来越重要的作用。在此，我们完整地梳理了VLP疫苗现有生化、生物物理、生物学特性相关的检测指标和分析方法，并对WHO 关于HPV-VLP的一些常规检查项进行了补充。
耀海生物，深耕微生物表达体系CRDMO服务领域，基于大肠杆菌和酵母表达体系，已搭建了成熟完善的重组蛋白CRDMO一站式服务平台，具备重组蛋白疫苗工艺开发与GMP级重组蛋白疫苗生产服务能力，包括VLP载体、VLP预防性或治疗性疫苗。
同时，公司建立了完善的理化、微生物学、生化、细胞功能学方面的质量检测平台，可根据不同产品的理化特性，建立不同产品的质量控制方法。丰富的实验室品质管理经验及分析检测能力，能够满足生物制品（重组蛋白、多肽类、VLP疫苗类、质粒产品等）放行检测要求，支持生物药开发生命周期的分析与质控需求。
截至目前，公司已成功完成多个VLP疫苗项目检测，能够熟练掌握VLP颗粒质量标准及检测项目标准，积极助力VLP疫苗的快速发展。
参考文献
[1]Carvalho SB, Silva RJS, Sousa MFQ, Peixoto C, Roldão A, Carrondo MJT, Alves PM. Bioanalytics for Influenza Virus-Like Particle Characterization and Process Monitoring. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Feb 18;10:805176.
[2]Tariq H, Batool S, Asif S, Ali M, Abbasi BH. Virus-Like Particles: Revolutionary Platforms for Developing Vaccines Against Emerging Infectious Diseases. Front Microbiol. 2022 Jan 3;12:790121.
[3]Zeltins A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 2013 Jan;53(1):92-107.
[4]Nooraei S, Bahrulolum H, Hoseini ZS, Katalani C, Hajizade A, Easton AJ, Ahmadian G. Virus-like particles: preparation, immunogenicity and their roles as nanovaccines and drug nanocarriers. J Nanobiotechnology. 2021 Feb 25;19(1):59.
[5]Shytuhina A, Pristatsky P, He J, Casimiro DR, Schwartz RM, Hoang VM, Ha S. Development and application of a reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for quantitation and characterization of a Chikungunya virus-like particle vaccine. J Chromatogr A. 2014 Oct 17;1364:192-7.
[6]Ruszkowski M, Strugala A, Indyka P, Tresset G, Figlerowicz M, Urbanowicz A. Cryo-EM reconstructions of BMV-derived virus-like particles reveal assembly defects in the icosahedral lattice structure. Nanoscale. 2022 Feb 24;14(8):3224-3233. doi: 10.1039/d1nr05650f. PMID: 35156989.
[7]Jeong H, Park Y, Song S, Min K, Woo JS, Lee YH, Sohn EJ, Lee S. Characterization of alfalfa mosaic virus capsid protein using Cryo-EM. Biochem Biophys Res Commun. 2021 Jun 25;559:161-167.
[8]Shank-Retzlaff ML, Zhao Q, Anderson C, Hamm M, High K, Nguyen M, Wang F, Wang N, Wang B, Wang Y, Washabaugh M, Sitrin R, Shi L. Evaluation of the thermal stability of Gardasil. Hum Vaccin. 2006 Jul-Aug;2(4):147-54.
[9]Towne V, Zhao Q, Brown M, Finnefrock AC. Pairwise antibody footprinting using surface plasmon resonance technology to characterize human papillomavirus type 16 virus-like particles with direct anti-HPV antibody immobilization. J Immunol Methods. 2013 Feb 28;388(1-2):1-7.
[10]Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of recombinant human papillomavirus virus-like particle vaccines, Annex 4, TRS No 999, Retrieved April 30,2024,from 网页链接